yy.vip易游-橙皮素与盐酸巴马汀共无定形的制备、表征及体外活性评价

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　　。作为改善难溶性药物性能的重要策略，药物共无定形技术通过与配体分子间相互作用破坏药物的晶体结构，使药物分子处于热力学更稳定的无序状态，从而有效降低分子排列能垒。因其不仅显著增强难溶性药物溶解行为，还能改善无定形态的物理稳定性、抑制重结晶，并通过药物间协同作用提升疗效或降低不良反应而备受关注形成的共无定形表现出优异的稳定性；萘普生与吲哚美辛形成共无定形后不但稳定性增强，溶出速率也显著加快；而阿替洛尔与氢形成的共无定形系统则同时优化了物理稳定性、溶出行为及体内吸收，其联合用药方案在高血压治疗中展现出更佳疗效

　　橙皮素是一种天然黄酮类化合物，广泛存在于柑橘类水果中，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗肿瘤及免疫调节等多重药理活性[10-13]。然而，由于橙皮素极低的水溶性（16～40μg/mL）[14]，其口服后胃肠道吸收极为有限，难以在全身循环中达到治疗浓度。尽管药物共无定形技术已在多种难溶性药物中展现出显著优势，但目前针对橙皮素的共无定形研究仍鲜有报道。

　　相比之下，近年来药物共晶技术在改善橙皮素溶解度和理化性质方面已引起关注，如诺氟沙星-橙皮素共晶可提升橙皮素在水中溶解度[15]；胡椒碱-橙皮素共晶能显著提升橙皮素生物利用度约6倍[16]；替莫唑胺-橙皮素共晶则表现出增强的吸湿性[17]。本课题组前期通过药物共晶技术制备了盐酸巴马汀与橙皮素的共晶多晶型（FormI和FormII），二者化学组成相同且均存在O-H···Cl⁻氢键作用，表现出较高的物理稳定性；然而，由于分子排列与氢键网络不同，两者的晶体堆积与晶格能存在显著差异，导致其溶解度表现迥异，其中FormII中盐酸巴马汀与橙皮素的溶解度均明显低于FormI[18]。

　　本研究旨在通过药物共无定形技术开发新的固体形态改善难溶性橙皮素的溶解行为。通过优化实验条件，选择合适的制备方法，最终以甲醇为溶剂采用旋转蒸发法成功制备了橙皮素与盐酸巴马汀共无定形（hesperetin and palmatine hydrochloride co-amorphous system，Hes-PH CAS），并利用粉末X射线衍射仪、差示扫描量热仪、固体核磁共振波谱仪、动态水蒸气吸附仪等对其固体形态进行系统考察，并利用高效液相色谱仪等评估其溶解度、溶出速率等理化性质，进一步通过自由基清除和细胞增殖抑制实验评估了其体外抗氧化与抗肿瘤活性。

　　Smart Lab SE型粉末X射线衍射仪，日本理学株式会社；DSC 214 Nevio型差示扫描量热仪、TG 209 F3型热重分析仪，德国耐驰仪器制造有限公司；Intrinsic Plus型动态水蒸汽吸附仪，英国Surface Measurement Systems公司；Nicolet iS 50型衰减全反射傅里叶红外光谱仪、DXR2拉曼光谱仪，美国赛默飞世尔科技公司；AVANCEIII核磁共振波谱仪，德国布鲁克公司；LC-20AD型高效液相色谱，日本岛津仪器有限公司；SPECTROstar Nano多功能酶标仪，德国BMG LABTECH科技有限公司；LHH-150SD型综合药品稳定性试验箱，上海一恒科学仪器有限公司；RC806ADK型溶出度测试仪，天津市天大天发科技有限公司。

　　1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，质量分数≥97.0%）、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS，质量分数≥98.0%），上海麦克林生化科技股份有限公司；原料药橙皮素、盐酸巴马汀三水合物，质量分数≥97.0%，大连美仑生物技术有限公司；过硫酸钾（质量分数≥99.0%），西陇科学股份有限公司；甲醇（色谱级），上海泰坦科技股份有限公司；磷酸（色谱纯），阿拉丁试剂（上海）有限公司。其他试剂均为分析纯，购自国药集团药业股份有限公司。人结肠癌细胞HT-29（目录号TCHu103）、HCT116（目录号TCHu 99），中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。

　　2.1.1Hes-PH CAS的制备将220.9 mg盐酸巴马汀三水合物（0.5 mmol）与橙皮素151.1 mg（0.5 mmol）置于80 mL甲醇中，超声处理直至全部溶解，0.45 μm滤膜滤过。滤液于40℃水浴、100 r/min转速条件下减压旋蒸，所得固体于真空干燥箱中干燥，即得Hes-PH CAS，避光保存于干燥器中。

　　2.1.2FormI和FormII的制备将盐酸巴马汀三水合物（221.3 mg，0.5 mmol）与橙皮素（151.7 mg，0.5 mmol）的混合物悬浮于10 mL乙醇中，持续搅拌48 h。滤过后，经室温干燥得到橙黄色粉末状产物，即得FormI共晶。除使用甲醇替代乙醇外，FormII共晶制备的其余条件与FormI的制备类似。

　　2.2.1粉末X射线衍射（powder X-ray diffraction，PXRD）分析将样品置于单晶硅样品台上，压成表面光滑后放在旋转台上。采用Cu-Kα射线作为入射光束，工作电压40 kV，工作电流15 mA，扫描范围2θ为5°～50°，步长0.02°。结果如图1所示，盐酸巴马汀与橙皮素原料药在5°～45°呈现一系列强而尖锐的特征衍射峰，表明其为高度结晶态。通过旋转蒸发法制备的Hes-PH CAS无特征衍射峰，仅存在一宽泛弥散峰，为无定形态。与通过悬浮法制备的HES-PCl共晶FormI和FormII[18]明显不同。

　　2.2.2差示扫描量热/热重分析（differential scanningcalorimetry/thermal gravity analysis，DSC/TGA）称样品置于铝制坩埚中，密封并扎孔后进行测试。以形同空坩埚作为参比，测试条件：温度范围30～300℃，升温速率10℃/min，氮气保护，体积流量40 mL/min。结果如图2-a所示，橙皮素原料药在229.8℃处出现吸热熔融峰，盐酸巴马汀原料药在204.3℃处亦呈现吸热峰；而Hes-PH CAS则无任何晶体熔融峰，仅具有单一的玻璃化转变温度（glass transition temperature，Tg）104.5℃，表明盐酸巴马汀与橙皮素经减压旋转蒸发后形成均相的共无定形。TGA结果（图2-b）显示，Hes-PH CAS在150℃前无明显质量损失，说明无残留溶剂，其Tg值测定未受干扰。

　　2.2.4固体核磁（solid-state NMR spectroscopy，ss-NMR）测试时，样品装入4 mm转子，以10.0 kHz旋转速率进行魔角旋转，并使用KBr法校准魔角设置。CP/MAS双脉冲相位调制在质子场H1H满足公式ω1H/2π＝γHH1H/2π＝60 Hz的获取时间内对异核解偶；检测共振频率为100.625 MHz，所有样品均采集480次扫描以获得足够的信噪比。化学位移校准以外部二级标准甘氨酸的亚甲基碳（δC甘氨酸＝43.3）为参考，并重新校准至TMS标度；所有ssNMR实验均在室温下进行。结果如图4所示，与橙皮素-盐酸巴马汀物理混合物（hesperidin and palmatine hydrochloride physical mixtures，Hes-PH PM）相比，Hes-PH CAS中多个碳信号发生显著偏移或消失。在δC50～60，橙皮素的C-16甲氧基碳和盐酸巴马汀的C18′、C19′、C21′和C20′ 4个甲氧基碳的信号发生变化；特别是在δ150处，橙皮素原料药的C-12、C-13苯基碳和盐酸巴马汀的C2′、C8′、C3′和C9′（连接甲氧基的4个苯基碳）信号亦发生改变。这些核磁谱信号的差异表明，橙皮素与盐酸巴马汀分子间可能存在O-H…O氢键作用或短程结构。特别地，在δC160～170，FormI与Hes-PH CAS均呈现3个核磁峰（分别归属为橙皮素中连接3个氧原子的C-6、C-4和C-8苯基碳），而FormII仅显示2个；且FormII在δ195处向低场方向偏移，这些差异进一步表明Hes-PH CAS与FormI在局部相互作用模式上更为相似，但整体仍为无定形态。此外，相较于FormI和FormII，Hes-PH CAS在橙皮素的C-2、C-1化学位移位置具有2个核磁信号，这一特征提示共无定形中可能存在与共晶不同的分子间作用力。

　　2.2.5稳定性分析将适量的Hes-PH CAS置于药品综合稳定性试验箱中，分别在光照强度为4 500 lx、温度为60℃条件下储存30 d，随后进行PXRD表征。PXRD图谱显示光照及高热（4 500 lx，60℃）条件下储存30 d后的Hes-PH CAS仍为无定形态（图5-a），表明其具有良好的光、热稳定性。进一步考察湿度对其稳定性影响，将样品置于40℃、75%相对湿度（relative humidity，RH）处理不同时间（图5-b）。结果表明，置于40℃、75% RH 10 h后，Hes-PH CAS出现衍射峰；随着时间延长，24 h后在衍射角7.9°、16.0°、24.7°及25.9°处衍射峰信号增强，其中24.7°、25.9°处衍射峰与FormII的特征峰（图1）基本一致，证实无定形态的Hes-PH CAS在受高湿作用后可能向FormII型转变。

　　2.2.6动态水蒸气吸附（dynamic vapor sorption，DVS）采用动态水蒸气吸附仪对样品的吸湿性能进行表征，称取适量待测样品，在25℃恒温条件下，以200 mL/min的氮气流量为载气，选择全循环吸附-脱附模式，设置步长为5%，以粉体质量变化率（dm/dt）≤0.002%/min作为平衡标准。结果如图6所示，在RH低于60%时，盐酸巴马汀的吸湿量随湿度升高而而显著增加，而橙皮素、FormI和FormII吸湿量则基本保持不变；在0～95% RH吸附过程中，Hes-PH CAS吸湿量随RH增加而逐渐上升，当RH达到95%时，其吸湿量为12.8%，高于FormI和FormII，但低于盐酸巴马汀原料药。表明形成共无定形后，橙皮素能够抑制盐酸巴马汀的吸湿行为。

　　2.3.1色谱条件色谱柱为中谱蓝XR-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），采用双波长模式，橙皮素吸收波长280 nm，盐酸巴马汀的吸收波长345 nm，体积流量1 mL/min，进样量5 μL，柱温30℃，流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液（60∶40），洗脱方式为等度洗脱。

　　2.3.2供试品溶液的配制精密称取10 mg Hes-PHCAS置于10 mL量瓶中，加入适量色谱甲醇超声至完全溶解，放至室温后甲醇定容，得1 mg/mL的供试品溶液。

　　2.3.3对照品溶液的配制精密称取橙皮素10 mg，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，摇匀即得1 mg/mL橙皮素对照品储备液。同法制备1 mg/mL盐酸巴马汀对照品储备液。

　　2.3.4专属性考察取稀释后的对照品溶液、供试品溶液，分别按照“2.3.1”项下色谱条件进样测定，结果见图7，供试品溶液在保留时间为2.0、4.1 min处分别与对照品盐酸巴马汀、橙皮素有相同色谱峰，分离度大于1.5，峰形良好，表明该色谱条件适用性良好。

　　2.3.5线性关系考察取“2.3.3”项下配制的质量浓度均为1 mg/mL的盐酸巴马汀、橙皮素对照品溶液，使用甲醇（色谱级）分别稀释至500、200、100、50、20、10、5 μg/mL，0.45 μm微孔滤膜滤过后进行HPLC检测，以峰面积（A）对质量浓度（C）进行线性拟合，得到盐酸巴马汀线性回归方程为A＝23 679C＋1 822，R2＝1.000 0；橙皮素线性回归方程为A＝15 954C＋23 535，R2＝0.999 9；结果表明橙皮素、盐酸巴马汀均在5～500 μg/mL线性关系良好。

　　2.3.6精密度考察取“2.3.2”项下供试品溶液进行稀释，制成Hes-PH CAS质量浓度为50 μg/mL的供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果橙皮素和盐酸巴马汀峰面积的RSD分别为0.35%、0.67%，表明该仪器精密度良好。

　　2.3.7稳定性考察取“2.3.2”项下供试品溶液进行稀释，制成Hes-PH CAS质量浓度为50 μg/mL的供试品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件，分别在制备后0、2、4、8、12、24 h进样分析，记录峰面积，24 h内橙皮素和盐酸巴马汀峰面积的RSD分别为2.51%、2.39%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

　　2.3.8重复性考察取Hes-PH CAS样品，按照“2.3.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进行稀释，制成Hes-PH CAS质量浓度为50 μg/mL的供试品溶液，分别按照“2.3.1”项下色谱条件进样分析，记录峰面积。结果橙皮素和盐酸巴马汀质量分数的RSD分别为1.14%、0.97%，表明该方法重复性良好。

　　2.3.9加样回收率考察取Hes-PH CAS样品，制成含橙皮素质量浓度为50 μg/mL的储备液。精密量取9份该储备液1 mL，加入等体积质量浓度分别为40、50、60 μg/mL的橙皮素对照品溶液，各平行3份。按照“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算橙皮素的加样回收率。同法计算盐酸巴马汀的加样回收率。结果橙皮素、盐酸巴马汀的平均加样回收率分别为（102.48±9.63）%、（98.26±2.62）%，表明该方法准确度良好。

　　2.3.10平衡溶解度考察分别称取适量样品置于纯水中，直至样品未全部溶解获得过饱和溶液，37

　　℃振荡48 h，取上层溶液0.45 μm微孔滤膜滤过后，进行HPLC检测，记录峰面积并计算平衡溶解度，结果如表1所示。在纯水中，原料药橙皮素与盐酸巴马汀的平衡溶解度分别为（21.22±0.58）μg/mL与（24.13±0.67）mg/mL。而在共无定形中，两者的溶解度发生了显著变化。橙皮素平衡溶解度提升至（105.42±6.50）μg/mL、盐酸巴马汀溶解度则降低至（10.06±0.14）mg/mL。而且，橙皮素与盐酸巴马汀的溶解度差异在共无定形中显著降低，从原料药的约1 100倍降至95倍。值得注意的是，共无定形中橙皮素与盐酸巴马汀的溶解度均介于FormI与FormII溶解度之间，说明所制备的共无定形分子堆积模式所导致的能量状态也处于2种共晶的中间。在溶解度实验后收集残渣进行PXRD测试进一步探究其固体形态，图谱结果显示，该残渣呈现明显衍射峰信号（图8），经与FormII衍射图谱对比，其衍射峰分布及相对强度均与之基本一致，说明Hes-PH CAS在溶解过程中向FormII型转变。

　　2.3.11溶出速率考察实验采用小杯桨法，水作为溶出介质，体积250 mL，转速75 r/min，温度37℃。待介质温度稳定后将待测样品投入介质中。设置多个时间点进行取样，每次取样后立即补充等体积介质。所取样品0.45μm微孔滤膜滤过后进行HPLC检测，每组均设置3个平行样。结果如图9所示，盐酸巴马汀原料药表现出显著的快速溶解特性，5 min内几乎完全溶解；而橙皮素原料药溶出释放缓慢，4 h后最大溶出率仅约4%。形成共无定形后显著改变了两者的溶出行为，盐酸巴马汀初始溶出速率较快，4 h后逐渐减缓并趋于平衡，最终在24 h的溶出率约为90.5%；橙皮素的溶出率与溶出速率均显著提高，在4～12 h维持较高的溶出水平，有效延长了药物浓度维持时间，8 h左右达到最大溶出率（62.2%）。

　　进一步与FormI、FormII比较发现，共无定形中盐酸巴马汀在4 h前的溶出速率同FormII接近，但在4 h后溶出速率变缓；而共无定形中橙皮素的溶出率较FormI与FormII有所提高，尤其是8 h时均高于2个共晶的最大溶出率。

　　通过DPPH和ABTS自由基清除法测定样品抗氧化能力，具体实验方法如下：DPPH自由基清除实验中，先用乙醇配制浓度为60μmol/L的DPPH溶液，分别取100μL不同浓度的待测样品和DPPH溶液加入到96微孔板中，设置3组平行样，避光反应30 min后，用酶标仪测定517 nm处吸光度（A）值；ABTS自由基清除实验中，先将7 mmol/L ABTS储备溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液混合制得ABTS+·溶液，使用前于室温避光放置16 h，并用无水乙醇稀释至734 nm处A值约为0.7，然后分别取100 μL不同浓度的测试样品和ABTS+·溶液加入到96微孔板，混合30 min后测定734 nm处A值。自由基清除率均按照公式清除率＝(Ab−As)/Ab计算，其中Ab和As分别为空白孔和样品孔A值。结果如表2所示，橙皮素与Hes-PH CAS对2种自由基清除率均随着样品浓度增加而增加。在12.5～400.0μmol/L，Hes-PH CAS的自由基清除活性均高于2种原料药，说明共无定形中2种药物能够更好地对自由基清除发挥作用。

　　肿瘤细胞抑制作用通过MTT试验测定，选用人结肠癌细胞HT-29和HCT116作为模型。将细胞以4.0×103个/孔密度接种于96孔板中，在CO2培养箱中孵育过夜后，用不同浓度的样品处理细胞48 h，随后每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL，溶于PBS）孵育4 h，移去上清液后加入200μLDMSO振荡10 min，最后用酶标仪测量570 nm波长处A值。细胞增殖抑制率按公式［抑制率＝(Ac－As)/(Ac－Ab)］计算，其中Ac、As和Ab分别是对照孔、样品孔和空白孔A值。结果如图10所示，HT-29和HCT 116细胞的增殖抑制率均随Hes-PH CAS浓度增加而逐渐增加，在6.25～400.00μmol/L，Hes-PH CAS对2种细胞的增殖抑制率均显著高于橙皮素和盐酸巴马汀原料药。通过拟合数据分析发现，Hes-PH CAS对HT-29和HCT 116细胞半抑制浓度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分别为26.1、43.6μmol/L，明显低于橙皮素和盐酸巴马汀原料药。结果表明橙皮素与盐酸巴马汀形成共无定形后，其抗肿瘤细胞增殖效果显著优于原料药。